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獸醫(yī)微生物的實(shí)習(xí)報(bào)告
一．實(shí)習(xí)目的
為了使學(xué)生能夠理論聯(lián)系實(shí)際，通過(guò)親自實(shí)地解剖感染小鼠，對(duì)小鼠的心、肝、脾進(jìn)行麥康凱瓊脂平板劃線培養(yǎng)，以柯赫法則為這次實(shí)習(xí)的主線，達(dá)到鑒定出小鼠感染的菌種的目的，熟練運(yùn)用微生物實(shí)驗(yàn)課的所涉及的實(shí)驗(yàn)操作和方法，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力，分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能出現(xiàn)的問(wèn)題，并解決問(wèn)題。特開(kāi)設(shè)微生物教學(xué)實(shí)習(xí)，掌握基本技能，加深理論部分的理解，能夠獨(dú)立診斷出傳染病病菌，獲得嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)實(shí)驗(yàn)素養(yǎng)。
二．實(shí)習(xí)材料
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：一只被感染小鼠，一只健康小鼠
實(shí)驗(yàn)器械，主要包括：小鼠解剖工具手術(shù)剪、鑷子、蠟盤(pán)、釘子，接種棒、酒精燈、打火機(jī)、記號(hào)筆、手套、載玻片、槍頭、注射器、離心管。
實(shí)驗(yàn)材料：麥康凱瓊脂平板、各種染色液（結(jié)晶紫溶液、碘溶液、酒精、沙黃水）、蒸餾水、培養(yǎng)基（普通肉湯培養(yǎng)基、蛋白胨培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基）、PBS重懸液、生化試驗(yàn)材料（微量發(fā)酵管（葡、乳、枸、尿素、麥、甘醇、蔗、硫）、對(duì)二甲基氨基苯甲醛、乙醚、甲基紅、vp甲乙液）。
實(shí)驗(yàn)主要儀器：離心機(jī)，分光光度器，溫箱，搖床，超凈工作臺(tái)
三．實(shí)習(xí)內(nèi)容
以柯赫法則為主線，通過(guò)對(duì)感染小鼠的剖解采樣、分離培養(yǎng)、鏡檢、擴(kuò)增培養(yǎng)，然后把得到的純培養(yǎng)物對(duì)健康小鼠進(jìn)行再次接種以獲得被感染小鼠，再次重復(fù)以上操作，把獲得的純培養(yǎng)物通過(guò)鏡檢觀察和做生化實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定出感染小鼠的致病菌。
四．實(shí)習(xí)操作進(jìn)程
第一天：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、討論癥狀、分離剖解
1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：以小組為單位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，明確此次實(shí)驗(yàn)主要法則是：柯赫法則。在老師的指導(dǎo)下確定此次實(shí)習(xí)的主要步驟，討論實(shí)驗(yàn)中可能遇到的問(wèn)題以及注意事項(xiàng)。
2 討論癥狀：比較觀察健康小鼠與病鼠，可見(jiàn)到病鼠一般呈萎靡狀，不活躍。每組領(lǐng)取一只感染小鼠觀察癥狀，體表基本正常。
3 分離剖解：先將麥康凱瓊脂平板分三區(qū)，依次寫(xiě)上肝、脾、心。右手抓起小鼠尾巴，將小鼠搖暈，采用頸椎脫臼法將小鼠處死。將小鼠尸體仰臥固定于蠟盤(pán)上，充分露出胸腹部。先用小鼠腹部柔軟部用剪刀剪一小口，然后從該小口處往上、往下剪將皮毛剝離，剝離腹膜暴露出肝臟和脾，可觀察到有輕微的肝腫脹，顏色變淡。將肝和脾切開(kāi)一小口，用接種環(huán)取樣，在麥康凱瓊脂平板的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行劃線分離。再打開(kāi)胸腔觀察，可見(jiàn)胸腔有出血現(xiàn)象和凝血塊，剪開(kāi)心包膜，將心臟切一小口，用接種環(huán)取樣，在麥康凱瓊脂平板的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行劃線分離。寫(xiě)上班級(jí)組別，日期，置于溫箱中培養(yǎng)至第二天早上8點(diǎn)。
第二天：挑取單菌落，鏡檢，擴(kuò)增培養(yǎng)，重懸，測(cè)OD配濃度，小鼠腹腔注射
1 挑取單菌落：觀察麥康凱瓊脂平板上菌落的形態(tài)為圓形，邊緣整齊，表面光滑，暗紅色，圓心處顏色較邊緣淺。挑去單個(gè)菌落，畫(huà)上記號(hào)準(zhǔn)備做后續(xù)試驗(yàn)。
2 鏡檢：選取所挑選菌落的一半進(jìn)行抹片。取干凈玻片，滴半滴去離子水，用接種環(huán)挑取菌進(jìn)行抹片、干燥固定、采用格蘭染色法染色：草酸銨結(jié)晶紫染色1-2’，水洗，革蘭氏碘液媒染1-2’，水洗，95%酒精脫色約30’’-1’，水洗，沙黃水溶液復(fù)染10 ’ ’-30 ’ ’，水洗。吸干，鏡檢。觀察到該菌被染成紅色，是格蘭陰性菌。
3 擴(kuò)增培養(yǎng)：選取剩余的菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，置于溫箱培養(yǎng)9個(gè)小時(shí)至菌的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。
4 重懸測(cè)OD值配濃度：下午5點(diǎn)左右，將培養(yǎng)的菌轉(zhuǎn)入無(wú)菌小管中離心，離心后可見(jiàn)菌沉于管底，在超凈工作臺(tái)內(nèi)操作，去上清液，用槍頭吸取PBS液至去了上清液的菌管中，反復(fù)吹打使其重懸，然后再次離心，去上清，重懸，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)得OD590的值，配成2*10^7CFU濃度的菌液。
5 小鼠腹腔注射：每組挑選一只健康小鼠，在頭部或尾部做上記號(hào)，用右手抓住鼠尾，將其搖暈，令其前爪抓住鐵絲蓋上，然后用左手的拇指和食指捏住小鼠頭頸部皮膚，并翻轉(zhuǎn)左后使其腹部朝上，將其尾巴夾在左手掌與小指之間，右手把持注射器吸取2mL菌液，在股后側(cè)面插入針頭，先刺入皮下，后進(jìn)入腹腔，注射時(shí)阻力，皮膚也無(wú)泡隆起。注射完將小鼠放回鼠籠即可。
第三天：觀察小鼠發(fā)病情況
小組成員分時(shí)間段觀察小鼠感染情況，見(jiàn)小鼠瀕死的盡快解剖接種分離致病菌。若 一整天未見(jiàn)小鼠有異常情況的等第二天解剖
第四天：剖解劃線培養(yǎng)
雖然小鼠未見(jiàn)萎靡，由于預(yù)訂的感染時(shí)間差不多，可以進(jìn)行解剖接種第一天的操作，
可見(jiàn)體表有淤血點(diǎn)，剖開(kāi)的小鼠肝臟流出大量的血液。其余均同第一天的操作，將麥康凱瓊脂平板的上所接的菌置于溫箱中培養(yǎng)。
第五天：生化鑒定
觀察到平板上只有一個(gè)較小的暗紅色菌落，挑取該菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)9小時(shí)至細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期。下午6點(diǎn)觀察，培養(yǎng)液依舊是澄清的，很可能沒(méi)有長(zhǎng)菌。為做進(jìn)一步的驗(yàn)證，進(jìn)行生化試驗(yàn)。將該菌接入微量發(fā)酵管（）和蛋白胨以及葡萄糖蛋白胨中，培養(yǎng)至第二天看結(jié)果。
第六天：觀察結(jié)果，整理報(bào)告
生化試驗(yàn)無(wú)任何反應(yīng)，說(shuō)明接的菌為雜菌或污物，整理實(shí)驗(yàn)報(bào)告并分析失敗原因。
六．實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
此次試驗(yàn)失敗
給小鼠攻毒，未能分離出致病菌，因此也無(wú)法鑒定出小鼠被感染的病原菌為何種腸桿菌科
試驗(yàn)失敗原因可能有：
1、接種棒火焰消毒后，等待冷卻的時(shí)間過(guò)短，接種棒接種菌時(shí)將菌燙死
2、由于小鼠的免疫力強(qiáng)，使得感染小鼠的病原菌被免疫掉了，因此未接種到治病菌
3.給小鼠注射的量或濃度還不夠未能達(dá)到使小鼠感染的目的
4、在第一次從小鼠體內(nèi)分離出來(lái)的菌可能不是致病菌，或者麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)出來(lái)的 菌落不止一種，而我們挑選到的某一菌落恰好不是致病菌。
5、在進(jìn)行腹腔注射時(shí)，可能沒(méi)有注射到腹腔，而只注射到皮下，或者其它部位。
6、采樣時(shí)可能由于接種環(huán)未完全伸入到心、肝、脾的組織中，或者伸到的組織里 恰好沒(méi)有致病菌
7、可能由于小鼠感染的時(shí)間過(guò)短，還未達(dá)到菌生長(zhǎng)曲線的高峰期
七．思考與總結(jié)
1 此次試驗(yàn)失敗的原因有很多在我看來(lái)最有可能的原因有以下幾點(diǎn)：
（1） 小鼠免疫:由于這些小鼠是實(shí)驗(yàn)室的小鼠，長(zhǎng)期被用來(lái)做各種致病菌的實(shí)驗(yàn)，使得它們獲得一定的免疫，所以雖然注射了足夠使小鼠感染發(fā)病的劑量，但也被小鼠免疫掉了，而無(wú)法從小鼠體內(nèi)獲得病料。
（2） 病料不夠：從學(xué)姐那了解到，她們做攻毒實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物，都是將整個(gè)組織塊磨碎以后，再接到培養(yǎng)基上，而我們做實(shí)驗(yàn)是只是用接種棒挑取一點(diǎn)，接種棒上粘到的病料比較少或根本沒(méi)有，因此培養(yǎng)不出菌。
（3） 挑取的單菌落未必是致病菌：由于平板上長(zhǎng)出可能不止一種菌，因此挑到的單菌落，未必是致病菌。
2為什么擴(kuò)增出來(lái)的菌不直接注射小鼠，而要經(jīng)過(guò)離心？
因?yàn)榫赡軙?huì)產(chǎn)生毒素，若直接注射可能就無(wú)法判斷使小鼠發(fā)病的到底是毒素作用，還是因?yàn)椴【谛∈篌w內(nèi)繁殖感染而造成的。
3 腸桿菌科有哪些，特征有哪些？
學(xué)生自我鑒定：
2011年5月16號(hào)到21號(hào)期間進(jìn)行了維持一周的微生物實(shí)習(xí)，在微生物實(shí)習(xí)期間，我能夠做到主動(dòng)和小組成員交流、合作、解決問(wèn)題，認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)操作，學(xué)會(huì)靈活運(yùn)用自己的專業(yè)知識(shí)解決問(wèn)題。
通過(guò)這段時(shí)期的實(shí)習(xí)，我們對(duì)無(wú)菌操作有了進(jìn)一步的理解，掌握了儀器操作的基本技能，鞏固了理論部分的知識(shí)，也了解到公共衛(wèi)生意識(shí)的重要性。
實(shí)習(xí)不過(guò)短短的五天，在這短暫的五天內(nèi)，，我們有過(guò)發(fā)現(xiàn)時(shí)的喜悅，有過(guò)解剖小鼠時(shí)的緊張，有過(guò)培養(yǎng)不出菌時(shí)的困惑，但最終我們收獲了知識(shí)，也收獲了友誼，在合作中共同進(jìn)步，在困難中共同進(jìn)退，一切的困難便能迎刃而解。
這次微生物實(shí)習(xí)為我們專業(yè)的繼續(xù)拓展提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)，為動(dòng)物醫(yī)學(xué)本科專業(yè)的我們學(xué)習(xí)后續(xù)課程奠定扎實(shí)的基矗
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